การจัดเรียงคาริโอไทป์ (Karyotyping)

         การทำคาริโอไทป์ (karyotype) เป็นการศึกษารายละเอียดของโครโมโซมแต่ละแท่งในนิวเคลียสของเซลล์ของสิ่งมีชีวิต โดยศึกษาทั้งจำนวนและรูปร่างของโครโมโซม การทำคาริโอไทป์นิยมใช้โครโมโซมในระยะเมตาเฟส เพราะเป็นระยะที่มองเห็นโครโมโซมแต่ละแท่งชัดเจน เนื่องจากโครโมโซมมีการหดตัว (contraction) มากที่สุดและมีขนาดใหญ่ที่สุด

         การศึกษาคาริโอไทป์ช่วยให้มีความเข้าใจวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิตเพราะโครโมโซม อาจจะมีการเปลี่ยนแปลงได้ในระหว่างที่มีวิวัฒนาการ สิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันย่อมมีคาริโอไทป์เหมือนกัน และสิ่งมีชีวิตที่เกี่ยวข้องกันในสายวิวัฒนาการจะมีความสัมพันธ์กันทางคาริโอไทป์ ตัวอย่างเช่น มนุษย์กับลิงไม่มีหาง(ape) ซึ่งมีความใกล้ชิดกันในสายวิวัฒนาการ มนุษย์มีจำนวนโครโมโซมเท่ากับ 46 แท่ง (2n = 46) ส่วนลิงไม่มีหาง (ที่เหลือในปัจจุบันมี 4 ชนิด คือ ซิมแปนซี ชะนี กอริล่า และอุรังอุตัง ) ซึ่งถือว่ามีบรรพบุรุษร่วมกันกับมนุษย์ มีจำนวนโครโมโซมเท่ากับ 48 แท่ง (2n = 48) จากการศึกษาคาริโอไทป์พบว่าโครโมโซมรูปร่าง acrocentric 2 แท่ง ของพวกลิงไม่มีหาง เกิดการย้ายที่มาต่อกันเป็นโครโมโซมแท่งใหม่เรียกการเกิดแบบนี้ว่า Robertsonian translocation โครโมโซมแท่งใหม่นี้กลายเป็นโครโมโซมคู่ที่ 2 ในมนุษย์ ทำให้จำนวนโครโมโซมของมนุษย์มีอยู่เพียง 46 แท่ง ในทำนองเดียวกันนี้ การเกิด Robertsonian translocation ก็พบในสัตว์ชนิดอื่นๆด้วย เช่น ในกระบือปลักกับกระบือแม่น้ำ และในหมูป่ากับหมูบ้าน นอกจากนี้การศึกษาคาริโอไทป์ในมนุษย์ ยังทำให้ทราบถึงความผิดปกติของโครโมโซมได้ ซึ่งเป็นการวินิจฉัยโรคพันธุกรรมที่เกิดจากความผิดปกติของโครโมโซมวิธีหนึ่ง นับเป็นความสำคัญของการศึกษาคาริโอไทป์ในทางการแพทย์

         การจัดเรียงคาริโอไทป์ในอดีตก่อนที่จะมีการย้อมแถบโครโมโซม จะอาศัยค่าที่ได้จากการคำนวณ 2  ค่า คือ ค่าดัชนีของเซนโทเมียร์(centrometric index) ซึ่งค่านี้จะบอกตำแหน่งของ centromere  กับค่าความยาวสัมพัทธ์ของโครโมโซม(relative length) เป็นค่าความยาวของโครโมโซมที่ได้จากผลรวมของความยาวทั้งแขนสั้นและแขนยาว มาช่วยในการจับคู่โครโมโซม    เพื่อเรียงโครโมโซม    เพราะ     homologous chromosome จะมีค่า 2 ค่านี้ เท่ากันหรือใกล้เคียงกัน ซึ่งนายแพทย์ Trupin และ Lejeune เป็นคนคิดค้นขึ้นเป็นคนแรกตั้งแต่ปี ค.ศ 1971 ต่อมาได้มีการพัฒนาเทคนิคการย้อมแถบโครโมโซม (chromosome banding technique) ขึ้นมา เทคนิคใหม่นี้ช่วยให้เราศึกษารายละเอียดของโครโมโซมได้ดีกว่า วิธีในการย้อมแถบก็ไม่ยุ่งยากซับซ้อนจนเกินไปจึงนิยมใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบัน เทคนิคการย้อมแถบโครโมโซมได้ช่วยให้เราวิเคราะห์จับคู่ของโครโมโซมได้แน่นอนและแม่นยำมากขึ้น    สามารถเห็นความผิดปกติของโครโมโซมได้ชัดเจน      โดยเฉพาะความผิดปกติทางด้านโครงสร้าง (structure aberration)     ซึ่งการย้อมแบบธรรมดา (conventional staining) ไม่สามารถบอกได้ การย้อมแถบโครโมโซมมีหลายแบบ เช่น  การย้อมแถบแบบเรืองแสง (Q – banding ; Quinacrine mustard banding)  การย้อมแถบแบบจี (G – banding ; Giemsa banding) การย้อมแถบแบบซี (C – banding ; Constitutive heterochromatin banding หรือ Centromere banding) การย้อมแถบแบบเอ็นโออาร์ (NOR – banding ; Nucleolar organizer region banding) ซึ่งการย้อมแต่ละแบบจะให้แถบเพียง 2 ชนิดเท่านั้น คือแถบเข้ม (dark band) และแถบสว่าง (light band)

         รูปแบบหรือลวดลายของแถบเข้มและแถบสว่างบนโครโซมแต่ละแท่ง หรือแต่ละคู่ จะเป็นแบบจำเพาะและเป็นเอกลักษณ์ประจำตัวของแต่ละแท่งหรือแต่ละคู่ และจะมีลักษณะเหมือนกันหรือคล้ายกันมากในโครโมโซมที่เป็นคู่กัน (homologous chromosome) ด้วยเหตุนี้เองจึงทำให้เราสามารถจัดคาริโอไทป์หรือจับคู่ของโครโมโซมได้ หรือถ้าหากมีความผิดปกติต่างๆเกิดขึ้นบนโครโมโซมไม่ว่าจะเป็นการขาดหายไป (deletion) การมีส่วนเติมเพิ่มขึ้นมา (duplication) การขาดออกแล้วต่อสลับกับส่วนเดิม (inversion) การย้ายหรือแลกเปลี่ยนตำแหน่ง (translocation) หรือการมีจำนวนโครโมโซมขาดหายไปบางแท่ง (monosomy) หรือเพิ่มขึ้นมา (trisomy) เราก็สามารถตรวจพบได้อย่างแม่นยำและถูกต้อง แม้ว่าความผิดปกตินั้น จะไม่สามารถตรวจพบได้โดยการย้อมแบบธรรมดาก็ตาม

         วิทยาการและเทคนิคทางเซลล์พันธุศาสตร์ของคนและสัตว์ในปัจจุบันนี้ได้ก้าวหน้าไปมาก แต่สำหรับพืชแล้ว การย้อมแถบโครโมโซมในพืชยังไม่ค่อยแพร่หลายเหมือนเช่นที่กระทำกันในมนุษย์หรือสัตว์ เนื่องจากประสบปัญหาต่างๆ เช่น เซลล์พืชมีผนังเซลล์ (cell wall) คอยขัดขวางการย้อมแถบและที่สำคัญคือโครโมโซมของพืชในระยะเมทาเฟส (metaphase) มีการหดตัวมากเกินไป (highly contraction) ทำให้แถบที่ได้ไม่คมชัด (blur) ซึ่งกรณีเช่นนี้จะมีลักษณะเหมือนกันหมด ไม่ว่าจะเป็นโครโมโซมคนหรือโครโมโซมสัตว์ก็ตาม ถ้าหากโครโมโซมมีการหดตัวมากเกินไปแล้ว จะประสบปัญหาการย้อมแถบเสมอ การย้อมแถบที่นิยมทำกันในพืชมักจะเป็นชนิด C – banding ส่วน G – banding ถ้าย้อมในระยะเมทาเฟส แถบที่ได้จะไม่คมชัด แต่ถ้าย้อมในขณะโครโมโซมยังยาวอยู่ เพราะหดตัวไปไม่มากนัก เช่น ย้อมในระยะ prophase หรือ prometaphase แล้วจะเห็นแถบชัดเจนกว่า ดังนั้นการย้อมแถบแบบ G – banding ในพืชจึงนิยมศึกษาโครโมโซมในระยะ prophase หรือ prometaphase เทคนิคการศึกษาโครโมโซมก่อนระยะเมทาเฟสนี้เรียกว่า high resolution technique ซึ่งเป็นที่นิยมกันมาก โดยเฉพาะเซลล์พันธุศาสตร์ของมนุษย์ (human cytogenetics) เพราะเทคนิคนี้ทำให้ศึกษารายละเอียดของแถบ (band) แถบย่อย (sub – band) ของโครโมโซมได้มากกว่าศึกษาโครโมโซมในระยะเมทาเฟส ผลจากการศึกษาด้วยเทคนิคดังกล่าวทำให้ในปัจจุบันมีการค้นพบกลุ่มอาการใหม่ๆ (new syndrome) ที่เกิดจากความผิดปกติทางด้านโครงสร้างของโครโมโซมที่มีขนาดเล็ก(micro - aberration)ในคนเพิ่มขึ้นมากมาย เพราะความผิดปกติของโครโมโซมในชิ้นส่วนขนาดเล็กๆนี้ ถ้าตรวจในระยะเมทาเฟสจะไม่สามารถตรวจพบได้ แต่ปัจุบันนี้วิทยาการได้ก้าวมา ถึงการศึกษาเซลล์พันธุศาสตร์ระดับอณู(molecular cytogenetics) โดยเฉพาะเทคนิค multicolor FISH (multicolor fluorescence in situ hybridization) ทำให้สามารถศึกษารายละเอียดของยีนหรือดีเอ็นเอบนแท่งโครโมโซมได้

         ก่อนปี ค.ศ. 1956 ด้วยเทคนิคที่ยังไม่ดีพอ จึงทำให้เรามีความเข้าใจผิดคิดว่าจำนวนโครโมโซมของมนุษย์นั้นมีอยู่ 48 แท่ง (ซึ่งเท่ากับจำนวนโครโมโซมของพวกลิงไม่มีหาง) จนกระทั่งในปี ค.ศ. 1956 นายแพทย์ Tjio และ Levan จึงได้พิสูจน์ให้ทราบแน่นอนว่าจำนวนโครโมโซมของคนปกติมีอยู่ 46 แท่ง หรือ 23 คู่ (รูปที่ 11.1) นับตั้งแต่นั้นเป็นต้นมาวิทยาการทางด้านเซลล์พันธุศาสตร์ของมนุษย์ก็ได้เจริญรุดหน้ามาเป็นลำดับ มีการรายงานกลุ่มอาการของโรคพันธุกรรมที่เกิดจากความผิดปกติของโครโมโซมชนิดใหม่ๆ เพิ่มขึ้นอีกเป็นจำนวนมาก ยิ่งในช่วง 20 ปีที่ผ่านมาได้มีการพัฒนาเทคนิคที่ใช้ศึกษาโครโมโซมที่ได้ผลแม่นยำมากยิ่งขึ้น โดยเฉพาะเทคนิคการย้อมแถบโครโมโซม และเทคนิคการศึกษาโครโมโซมก่อนระยะเมทาเฟส ดังได้กล่าวมาแล้ว

2n = 46

รูปที่ 11.1  ภาพโครโมโซมของคนที่ย้อมแถบแบบจี(G - banding) มีจำนวนโครโมโซมเท่ากับ 46 แท่ง ซึ่งนายแพทย์ Tjio และ Levan ได้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่ามนุษย์มีจำนวนโครโมโซมอยู่ 46 แท่ง (หรือ 23 คู่) ไม่ใช่ 48 แท่ง ตามที่เข้าใจมานาน

        ปัจจุบันนี้การตรวจหาความผิดปกติของโครโมโซมกลายเป็นการตรวจทางห้องปฏิบัติการที่มีความจำเป็นในโรงเรียนแพทย์ ตามมหาวิทยาลัยหรือศูนย์แพทย์ ตามโรงพยาบาลใหญ่ๆ โดยเฉพาะการตรวจหาความผิดปกติของโครโมโซมขณะที่ทารกยังอยู่ในครรภ์มารดา (prenatal diagnosis) การศึกษาความผิดปกติของโครโมโซมของทารกที่ยังอยู่ในครรภ์มารดานั้น นิยมศึกษาจากเซลล์ในถุงน้ำคร่ำ (amniotic fluid cell) โดยการเจาะถุงน้ำคร่ำ เพื่อนำเซลล์น้ำคร่ำมาเพาะเลี้ยง จากนั้นเตรียมและวิเคราะห์โครโมโซม กรรมวิธีนี้ เราเรียกว่า Amniocentesis การเจาะน้ำคร่ำจะกระทำในช่วงอายุครรภ์ประมาณ 18 – 20 สัปดาห์ อีกวิธีหนึ่งคือการศึกษาโครโมโซมทารกโดยตรงจากเนื้อเยื่อรกหรือโคเรียน (chorion tissue) เนื่องจากเซลล์จากเนื้อเยื่อนี้มีการแบ่งตัวสูง กรรมวิธีการเตรียมโครโมโซมเพื่อวินิจฉัยแบบนี้ เรียกว่า chorionic villi sampling หรือ CVS

         ขั้นตอนการเตรียมและการวิเคราะห์โครโมโซม

         การศึกษาโครโมโซมของคนที่นิยมทำกันมากที่สุดและสะดวกที่สุด คือ การเตรียมโครโมโซมจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ลิมโฟซัยส์ (lymphocyte culture) ในหลอดทดลองโดยมีขั้นตอนเหมือนกับปฏิบัติการบทที่ 10 ตั้งแต่การเจาะเลือดเพื่อนำเซลล์เม็ดเลือดขาวกลุ่มลิมโฟซัยส์มาเลี้ยงกับอาหารสังเคราะห์ (chromosome media) ที่มีสารกระตุ้นให้เซลล์แบ่งตัว (mitogen) ปนอยู่ สาร mitogen ที่นิยมใช้มาก คือ phytohaemagglutinin (PHA) เป็นสารที่สกัดได้จากพืชตระกูลถั่ว มีฤทธิ์กระตุ้นเซลล์ลิมโฟซัยต์กลุ่มที (T - lymphocyte) เท่านั้น จากนั้นบ่มไว้ในตู้บ่ม (incubator) อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 5 เปอร์เซ็นต์คาร์บอนไดออกไซด์ (CO2) นาน 48 – 72 ชั่วโมง แล้วหยดสาร colchicine หรือ colcemid (อนุพันธ์ของสารโคลชิซีน) ลงไป เพื่อหยุดให้เซลล์ค้างอยู่ในระยะเมทาเฟส สาร colchicine นี้สะกัดได้จากต้น autum crocus (Colchicium autumnale) เป็นสารที่มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างสาย spindle fiber โดยห้ามการจับกันของโปรตีน tubulin ซึ่งเป็น binding block ของ microtubule ที่เป็นองค์ประกอบของ spindle fiber แล้วนำไปใส่ในสารละลายเกลือเจือจาง (hypotonic solution) เพื่อทำให้เซลล์บวม ทำให้โครโมโซมมีการกระจายตัวดีขึ้น จากนั้นตรึงเซลล์ (fix) ด้วยน้ำยารักษาสภาพเซลล์ หรือ fixative หยดเซลล์ที่ตรึงแล้วลงบนสไลด์ที่สะอาด โครโมโซมที่อยู่บนสไลด์ นำมาย่อยโปรตีนบางส่วนออกด้วยเอ็นไซม์ทริปซิน (trypsin) ในกรณีที่ย้อมแถบแบบ G – banding แล้วย้อมด้วยสี giemsa หรือสีชนิดอื่นๆตามแต่ชนิดของการย้อมแถบโครโมโซม จากนั้นวิเคราะห์โครโมโซมภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ถ่ายรูป ล้าง อัดขยายรูป แล้วนำมาจัดคาริโอไทป์ (รูปที่ 11.2)

         จำนวนโครโมโซมของคนปกติมีอยู่ 46 แท่ง หรือ 23 คู่ ทั้งใน ผู้หญิงและผู้ชายจะมีโครโมโซม 44 แท่ง หรือ 22 คู่ ที่เรียกว่า autosome อีก 2 แท่ง หรือ 1 คู่ เรียกว่า sex chromosome โดย sex chromosome ในเพศชายจะเป็น XY และในเพศหญิงจะเป็น XX ดังนั้นในเพศชายปกติจึงเป็น 46,XY (รูปที่ 11.3) และในเพศหญิงปกติจึงเป็น 46,XX (รูปที่ 11.4)

         ในสัญลักษณ์คาริโอไทป์ตัวเลข 46 นั้นจะแทนจำนวนโครโมโซมทั้งหมดที่นับได้ภายในเซลล์ ซึ่งรวมทั้งออโตโซมและโครโมโซมเพศด้วย ส่วนสัญลักษณ์ XY หรือ XX หลังจุลภาค (,) นั้น แสดงโครโมโซมเพศของคนๆนั้นว่าเป็นเพศชายหรือเพศหญิง

         รูปที่ 11.2 ภาพไดอะแกรมแสดง banding chromosome ระยะเมทาเฟส โครโมโซมแต่ละแท่งจะแบ่งออกเป็นแขนสั้น (p) และแขนยาว (q) โดยถือเอาตำแหน่ง centromere เป็นหลักแต่ละแขนของโครโมโซมยังแบ่งออกเป็น region, band และ sub – band ตามลำดับ

         รูปที่ 11.3 แสดง G – banded karyotype ของเพศหญิงปกติ (46,XX

         รูปที่ 1.4 แสดง G – banded karyotype ของเพศชายปกติ (46,XY)

         รูปที่ 11.5. แสดง somatic metaphase ของผู้ป่วยที่เป็น Down syndrome (Trisomy 21 syndrome) มีโครโมโซมคู่ที่ 21 อยู่ 3 แท่ง (ลูกศรชี้)

         ในการฝึกหัดจัดคาริโอไทป์จากภาพถ่ายโครโมโซม (somatic chromosome) ที่นักศึกษาได้รับนั้น อันดับแรกที่ควรกระทำ คือ นับจำนวนโครโมโซมทั้งหมดที่มีอยู่ในเซลล์ว่ามีจำนวนเท่าไร จากนั้นถ้าต้องการทราบว่าจำนวนเป็นเพศชายหรือเพศหญิงให้นับโครโมโซมกลุ่ม B (คู่ที่ 4 และ 5) รวมกับกลุ่ม C (คู่ที่ 6,7,8,9,10,11,12 และเอ็กซ์โครโมโซม) ว่ามีอยู่กี่แท่ง ถ้าเท่ากับ 19 แท่งแสดงว่าเป็นเพศชาย ถ้าเท่ากับ 20 แท่ง แสดงว่าเป็นเพศหญิง จากนั้นก็ตัดโครโมโซมทีละแท่ง วางลงบนกระดาษแบบฟอร์มเรียงคาริโอไทป์ที่แจกให้(รูปที่ 11.6) โดยวางให้ตรงหมายเลขคู่ของโครโมโซมจนเสร็จเรียบร้อย แล้วใช้กาวติดภาพโครโมโซมแต่ละคู่

         การเรียง chromosome เรียงตามลำดับความยาว สำหรับ autosome เรียงตั้งแต่คู่ที่ 1 ยาวที่สุด จนถึงคู่ที่ 22 สั้นที่สุด นอกจากนั้นยังเรียงโดยคำนึงถึงตำแหน่งของ centromere ด้วย

         เนื่องจากหลักเกณฑ์ในการเรียง chromosome ดังกล่าวข้างต้นไม่แม่นยำพอ เมื่อถึงตอนเรียงจริงๆ ผู้เรียงจะไม่สามารถแยก chromosome คู่ที่มีขนาดใกล้เคียงกันและมีรูปร่างคล้ายกันออกจากกันได้ จึงมีผู้เสนอให้จัดรวม chromosome ที่มีขนาดใกล้เคียง และมีรูปร่างใกล้เคียงกัน และมีรูปร่างคล้ายกันออกเป็นกลุ่มๆ ออกเป็น 7 กลุ่มและเรียกชื่อกลุ่มตามด้วยตัวอักษรภาษาอังกฤษตั้งแต่ A ถึง G (ตารางที่ 11.1)ดังนี้

         ตารางที่ 11.1 ชื่อกลุ่ม หมายเลขคู่ ขนาด และรูปร่างของโครโมโซม

         เมื่อจัดคาริโอไทป์เสร็จแล้ว ก็ต้องมีการตรวจสอบก่อนรายงานผลการตรวจ ซึ่งขั้นตอนการแปลผล (interpretation) นี้ เป็นขั้นตอนที่สำคัญมาก นักเซลล์พันธุศาสตร์(human cytogeneticist)ต้องมีความเข้าใจและสามารถจดจำแถบ สัญลักษณ์ และคำย่อต่างๆได้เป็นอย่างดี