การเพาะเลี้ยงเซลล์ลิมโฟซัยส์ (Lymphocyte culture)

         การศึกษาโครโมโซมของมนุษย์ นิยมเตรียมโครโมโซมจากเลือด(peripheral blood)โดยวิธีการเพาะเซลล์ลิมโฟชัยส์ หรือ lymphocyte culture เพราะมีความสะดวกและประหยัดเวลาที่สุด มีขั้นตอนดังนี้

1. การเก็บตัวอย่างเลือด
เจาะเลือดประมาณ 2 – 3 ซีซี จากหลอดเลือดดำใต้แขนพับ ด้วยกระบอกฉีดยาและเข็ม แบบ ใช้ครั้งเดียวทิ้ง (disposable syringe) ที่มีสารป้องกันเลือดแข็ง (heparin) เคลือบอยู่ หลังจากเจาะเลือดเสร็จแล้วควรกลับกระบอกฉีดยาไปมา เพื่อให้เลือดกับ heparin ผสมกันอย่างทั่วถึง
2. การเพาะเลี้ยงเซลล์ลิมโฟซัยต์
ใส่เลือดที่ได้จากข้อ 1 ประมาณ 15 หยด (หลังจากเอาเข็มเจาะเลือดออกแล้ว) ลงในขวดที่มี สารต่อไปนี้ โดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อ
• chromosome media ชนิด RPMI 1640     4     ซีซี
• ซีรัมจากลูกวัวอ่อน      1     ซีซี
• ยาปฏิชีวนะ(penicillin - streptomycin)   0.3    ซีซี
• สารกระตุ้นให้เซลล์แบ่งตัว(phytohaemagglutinin) 0.1  ซีซี
ปิดฝาให้แน่น เขย่าเบาๆให้ทั่ว บ่มขวดเพาะเลี้ยงไว้ในตู้บ่มอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ นาน 3 วัน ในระหว่างเพาะเลี้ยงควรเขย่าขวดเลี้ยงเซลล์อย่างน้อยวันละครั้ง เพื่อเพิ่มปริมาณเมตาเฟสให้มากขึ้น
3. การเก็บเกี่ยวโครโมโซม
นำขวดเลี้ยงเซลล์มาเติม colchicine (0.2 mg/ml) หรือ colcemid ประมาณ 0.1 ซีซี เขย่าในสาร ผสมกันอย่างทั่วถึง แล้วบ่มต่ออีก 30 นาที จากนั้นจึงนำออกมาเทสารละลายลงในหลอดปั่น เพื่อเตรียมโครโมโซม
การเตรียมโครโมโซม มีขั้นตอนดังนี้
1. นำหลอดไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 2,500 รอบ/นาที นาน 5 นาที หลังจากนั้นดูดสารละลาย ส่วนบนทิ้งไป เหลือสารละลายไว้เหนือตะกอนเซลล์ ประมาณ 1 มิลลิลิตร
2. เติม 0.075 M KCl ประมาณ 10 มิลลิลิตร ลงในหลอด ผสมให้เข้ากันดีแล้วตั้งทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 15 – 20 นาที แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงอีกครั้ง แล้วดูดสารละลายส่วนบนทิ้งไป เหลือสารละลายไว้เหนือตะกอนเซลล์ ประมาณ 1 มิลลิลิตร
3. ผสมเซลล์และสารละลายที่เหลือให้ผสมกันอย่างดี แล้วเติมน้ำยาคงสภาพ หรือ fixative โดยเติมช้าๆพร้อมกับเขย่าอย่างแรงเพื่อให้เซลล์เข้ากับสารละลายคงสภาพอย่างทั่วถึง เติมสารละลายคงสภาพจนได้ปริมาตรครบ 10 มิลลิลิตร แล้วนำไปปั่นที่ 2,500 รอบ/นาที นาน 5 นาที ลังจากนั้นดูดสารละลายคงสภาพส่วนบนทิ้งไป
4. ทำซ้ำขั้นตอนที่ 3 อีก 2 รอบ เพื่อล้างตะกอนจนเซลล์และกำจัดเศษขยะของเซลล์ (cell debris) ออกจนได้ตะกอนสีขาวที่ก้นหลอด
5. หลังจากปั่นครั้งสุดท้าย ดูดสารละลายส่วนบนทิ้งไปเกือบหมด เหลือสารละลายไว้เหนือ ตะกอนเซลล์ (cell pellet) ประมาณ 0.5 มิลลิลิตร เติม สารละลายคงสภาพ อีกประมาณ 1 มิลลิลิตร ผสมตะกอนและน้ำยาคงสภาพให้เข้ากันดี (resuspension) ด้วย pasteur pipette จะเห็นเซลล์สีขาวๆลอยอยู่ในน้ำยาคงสภาพ (cell suspension)
6. ใช้ pasteur pipette หยดสารละลายเซลล์ 1 หรือ 2 หยดลงบนสไลด์ที่สะอาด โดยหยด ให้สูงจากสไลด์ประมาณ 2 – 3 ฟุต
7. วางสไลด์ลงบน hot plate หรือฝา water bath ที่ตั้งอุณหภูมิ ไว้ที่ 80 – 90 oC เมื่อสไลด์แห้ง ดีแล้วนำมาย้อมสี giemsa หรือย้อมแถบโครโมโซมแบบมาตรฐาน จากนั้นนำไปส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์

การเตรียมสี Giemsa

         ละลายผงสี Giemsa 0.75 กรัมในกลีเซอรอล 25 มิลลิลิตร และ absolute methanol 75 มิลลิลิตร โดยบดและผสมผงสี Giemsa ให้ละลายจนหมด จากนั้นเก็บไว้ในขวดสีชาที่อุณหภูมิ 37 oC นาน 1 คืน สารละลายสี Giemsa ที่เตรียมได้นี้คือ stock Giemsa solution

การเตรียม phosphate buffer pH 6.8 (soresen , s buffer)
1. ชั่งผลึก K2HPO4 9.1 กรัม ละลายในน้ำกลั่น 1 ลิตร สารละลายที่ได้นี้เรียก stock A
2. ชั่งผลึก NaH2PO4 9.5 กรัม ละลายในน้ำกลั่น 1 ลิตร สารละลายที่ได้นี้เรียก stock B

         ในการย้อมสีโครโมโซมและย้อมแถบโครโมโซม จะใช้ 10% Giemsa ในสารละลาย 0.01 M phosphate buffer pH 0.8 โดยกระทำดังนี้ เตรียม 0.01 M phosphate buffer pH 6.8 โดยใช้สารละลาย stock A 50.2 มิลลิลิตร ผสมกับสารละลาย stock B 49.2 มิลลิลิตร แล้วนำมาเตรียม 10% Giemsa โดยใช้ phosphate buffer pH 6.8 90 มิลลิลิตร ผสมกับ stock Giemsa solution 10 มิลลิลิตร แล้วกรองด้วยกระดาษกรอง ก่อนใช้เสมอ

ขั้นตอนการเตรียมโครโมโซม

ตัวอย่างเลือด (whole blood)
เพาะเลี้ยงเซลล์ลิมโฟไซต์  (lymphocyte culture)
เก็บในตู้บ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ		37 oC  นาน 72 ชั่วโมง
เก็บเกี่ยวเซลล์ (harvest) ใส่สาร colcemid เพื่อให้โครโมโซมหยุดการแบ่งตัวที่ระยะเมทาเฟส (metaphase)
หยดเซลล์ลงบนสไลด์  (slide making)
ย้อมด้วยสีจิมซา   (Giemsa staining)
ส่องดูโครโมโซมด้วยกล้องจุลทรรศน์ (microscopy)

รูปที่ 10.1 การทำเตรียมโครโมโซม

 การวิเคราะห์โครโมโซม (chromosome analysis)

         การวิเคราะห์โครโมโซมเป็นงานที่ละเอียดอ่อน ผู้ฝึกฝนต้องเพ่งสายตาพิจารณาโครโมโซมภายใต้กล้องจุลทรรศน์ครั้งละนานๆ เป็นชั่วโมงหรือมากกว่า การฝึกตรวจวิเคราะห์โครโมโซมนั้นกว่าจะสามารถตรวจวิเคราะห์ได้ทุกตัวไม่ผิดพลาดจะใช้เวลาประมาณ 1 เดือน หรือมากกว่า แต่กว่าจะสามารถตรวจวินิจฉัยโครโมโซมของผู้ป่วยได้ถูกต้องจะใช้เวลาอย่างน้อย 1 ปี ยิ่งถ้าเป็นการตรวจวินิจฉัยโครโมโซมก่อนคลอด จะต้องมีประสบการณ์มากเป็นพิเศษ

โครโมโซมมนุษย์แบ่งตามตำแหน่งของเซนโทรเมียร์ แบ่งเป็น 3 ประเภท ได้แก่
1. metacentric chromosome เซนโทรเมียร์จะอยู่บริเวณกลางโครโมโซม ได้แก่ โครโมโซมคู่ที่ 1 3 19 20
2. submetacentric chromosome เซนโทรเมียร์อยู่ค่อนไปปลายด้านใดด้านหนึ่ง ได้แก่ โครโมโซมคู่ที่ 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 18 และ X
3. acrocentric chromosome เซนโทรเมียร์อยู่ชิดปลายของโครโมโซม จะมีโครมาตินเล็กๆเป็น ส่วนหนึ่งของแขนสั้น เรียกว่า satellite ได้แก่ โครโมโซมคู่ที่ 13 14 15 21 22 และ Y สำหรับบนโครโมโซม Y จะไม่มี satellite
   
   

   1. metacentric	2. sub metacentric
   3. acrocentric
   ภาพโครโมโซม กลุ่มอาการ Double Y syndrome(47XYY)
   เครื่องมือจัดเรียงโครโมโซมอัตโนมัติ (automated chromosome analyzer)